Servicii de diagnosticare

Până de curând, diagnosticarea boreliozei era posibilă pentru români doar în alte țări. Înmulțirea cazurilor de boală Lyme a făcut necesară deschiderea unor centre de diagnosticare și la noi. De fapt, această înmulțire se explică și prin faptul că pacienți despre care se credea că suferă de poliartrită, scleroză în plăci sau alte boli au, de fapt, borelioză – lucru dovedit în urma unor teste de mare precizie care acum sunt disponibile.

Testele realizate de Lyme Diagnostic (foto 1), de la Western Blot la microscopie în câmp întunecat, permit diagnosticarea diferențiată a boreliozei mai rapid, ceea ce oferă șansa pacientului de a începe să urmeze un tratament corect din faza incipientă a bolii. Laboratorul este echipat conform celor mai moderne standarde, iar specialiștii noștri au experiență în diagnosticarea și consilierea pacienților, în funcție de rezultatele analizelor.

Pentru diagnosticare bolii Lyme este necesară efectuarea unor teste (foto 2), ale căror rezultate serologice confirmă sau infirmă prezența bacteriei Borrelia Burgdorferi.

Lyme Diagnostic oferă mai multe tipuri de teste pentru boala Lyme, reprezentative fiind Western Blot, IIF și microscopia în câmp întunecat.

Diagnosticare imunofluorescenta

Testele de imunofluorescenta indirecta reprezinta la momentul actual cel mai eficient test de screening pentru borrelioza.
Testele care se lucreaza in laboratorul nostru sunt produse de firma EUROIMMUN Germania – producatorul nr 1 in lume in acest domeniu.
Laboratorul nostru este inclus in programul international de control al calitatii atat cu Euroimmun cat si cu Laboratorul de referinta pentru borrelii din Germania .
Pentru diagnosticul borreliozei sunt luate in calcul mai multe tehnici de evidentiere a anticorpilor anti-borrelia ;: ELISA , imunofluorescenta indirecta ( IIF) , hemaglutinarea pasiva si imunoblotul. In general sunt folosite pentru screening testele ELISA sau IIF.
Recomandarile OMS si ghidurile din SUA si Germania pentru diagnosticul borreliozei sunt pentru o procedura in 2 pasi:
1.ELISA sau IIF teste utilizate pentru screening
2.imunoblot pentru confirmare in cazurile positive

In cazul infectiilor recente se recomanda testarea in paralel IIF si blot intrucat unele reactii slab pozitive pot fi detectate mai rapid pe blot decat pe testul de screening

VlsE este cel mai sensibil antigen pentru detectia de anticorpi de tip IgG, iar OspC pentru anticorpii de tip IgM- antigene prezente in lamele noastre de IIF.

Principiul testului se bazeaza pe evidentierea anticorpilor anti-borrelia (afzelii, garinii, burgdorferi sensu – stricto) prin folosirea unui frotiu cu borrelii ca substrat standard si vizualizarea lor cu un pattern fluorescent pentru fiecare tulpina in parte.
Exista doua modalitati de lucru calitativ si cantitativ.
Pentru evaluarea calitativa care ofera doar un rezultat pozitiv / negativ, proba se lucreaza doar la dilutie 1/100 pentru IgG si dilutie 1/10 pentru IgM.
Pentru evaluarea cantitativa se lucreaza dilutii succesive incepand cu 1/10; 1/100, 1/1000, 1/10 000, valori ce ofera informatii asupra marimii infectiei. Titrul de anticorpi este dat de dilutia cea mai mare la care se obtine fluorescenta.Poate fi utilizata in monitorizarea tratamentului.

EVALUARE CALITATIVA

Reactivitate  IgG Evaluare
Lipsa reactiei la 1/100 Negativ – infectie neevidentiata
Prezenta la 1/100 Pozitiv – marker de infectie recenta /cronica cu borrelia

 

Reactivitate  IgM Evaluare
Lipsa reactiei la 1/10 Negativ – infectie neevidentiata
Prezenta la 1/10 Pozitiv – marker de infectie recenta /exceptional cronica cu borrelia

EVALUARE CANTITATIVA

Titrul de anticorpi este dat de  dilutia cea mai mare la care se obtine fluorescenta evidenta .

 

                              FLUORESCENTA  POZITIVA Titru anticorpi
1:10 1: 100 1: 1000 1: 10 000
slab negativ negativ negativ   1: 10
moderat negativ negativ negativ   1: 32
intens slab negativ negativ   1: 100
intens moderat negativ negativ   1: 320
Intens intens slab negativ   1: 1 000
Intens intens moderat negativ   1: 3 200
intens intens intens slab   1 : 10 000

 

 

O crestere de doua sau mai multe ori a titrului  IgG in decurs de doua saptamani indica o infectie recenta.

Pentru diagnostic se iau in considerare intotdeauna simptomatologia clinica coroborata cu rezultatele serologice.

 

In diagnosticul neuroborreliozelor determinarea titrului de anticorpi din LCR impreuna cu cel sanguin este de o importanta cruciala , determinarea indexului de anticorpi ( AI ) facand diferenta dintre derivatii din sange si derivatii patologici specifici  ai creierului .

Diagnosticare prin Western Blotting

Acest test realizat în laboratorul Lyme Diagnostic permite depistarea în sânge a anticorpilor specifici anti-Borrelia de tip IgG și IgM formați de organism. Este un test imunologic realizat fie pentru a descoperi anticorpii produși de organism care confirmă existența bolii Lyme, fie pentru a verifica rezultatele unui test ELISA realizat anterior.

 

Testul Western Blot are o specificitate ridicată, adică este pozitiv doar la persoanele care sunt în mod cert infectate.

 

Western Blotting-ul presupune recoltarea unei mostre de sânge, centrifugarea sa cu ajutorul unui aparat special, aplicarea de ser pe stripuri și prelucrarea acestora într-un aparat care „citește” informația cuprinsă în aceste probe și oferă un grafic privind proteinele prezente (foto 3). Medicul de laborator interpretează apoi rezultatele, pe baza protocolului indicat de producătorii aparatului, evidențiind proteinele specifice, ultraspecifice și comune.

 

Dacă rezultatul testului este pozitiv, persoana investigată este infectată cu bacteria Borrelia burgdorferi. Dacă rezultatul testului este negativ, însă există suspiciune de boală (în cazul în care recoltarea probei de sânge s-a făcut la puțină vreme după momentul presupus al contactului cu bacteria), medicul va recomanda repetarea testului după câteva săptămâni.

 

Mai multe informații despre Western Blot puteți citi în capitolul Teste de pe acest site.

 

Teste WB pentru borrelii

Mai multe informații specifice, dedicate medicilor și specialiștilor, vă invităm să citiți în documentele de mai jos, referitoare la testele Western Blot pentru identificarea Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii și Borrelia garinii.

 

Fiecare material cuprinde o descriere a antigenilor împotriva borreliei respective (IgG sau IgM), Instrucțiuni de utilizare pentru EUROLINE-WB, Compoziția kit-ului, Prepararea și stabilitatea reagenților, Prepararea și stabilitatea mostrelor de ser sau plasmă, Incubarea și Protocolul de incubare specific, Evaluarea și interpretarea rezultatelor, Caracteristicile testului, Semnificația clinică, Referințe

 

Borrelia burgdorferi IgM – download

Borrelia afzelii IgG – download

Borrelia afzelii IgM – download

Borrelia garinii IgG – download

Borrelia garinii IgM – download

Teste recomLine Borrelia IgG și recomLine Borrelia IgM de la Mikrogen – download

 

Diagnosticare prin microscopie în câmp întunecat

Pana de curand considerată cea mai sigură metodă de diagnosticare a boreliozei, microscopia în câmp întunecat (DFM – darkfield microscopy) oferă posibilitatea observării directe, în proba recoltată, a spirochetelor, ale căror dimensiuni sunt foarte mici. Organismele transparente/necolorate, cum sunt și nanobacteriile, nu se pot vizualiza în lumină directă, dar devin vizibile în lumină indirectă.

Actualmente este utila pentru vizualizarea spirochetelor si a coinfectiilor.

 

Microscopul, capabil să mărească foarte mult datorită sistemului optic performant, este dotat cu un disc ce blochează lumina, lăsând doar o rază concentrată să ajungă la proba vizualizată. În felul acesta, elementele apar luminoase pe un fundal întunecat (foto 4).

 

Microscopia în câmp întunecat (foto 5) are multe aplicații și ajută la identificarea nu doar a borreliilor (din care există peste 30 de specii), ci și a altor spirochete (spirilium, leptospirele, treponemele etc.), precum și a co-infecțiilor.

 

Lyme Diagnostic este printre puținele laboratoare de la noi care oferă acest tip de test și este specializat în diagnosticarea diferențiată a borreliilor, ceea ce ajută la stabilirea tratamentului potrivit pentru pacienții cu borelioză.
Considerată pana de curand cea mai sigură metodă de diagnosticare a boreliozei, microscopia în câmp întunecat (DFM – darkfield microscopy) oferă posibilitatea observării directe, în proba recoltată, a spirochetelor, ale căror dimensiuni sunt foarte mici. Organismele transparente/necolorate, cum sunt și nanobacteriile, nu se pot vizualiza în lumină directă, dar devin vizibile în lumină indirectă.

Microscopul, capabil să mărească foarte mult datorită sistemului optic performant, este dotat cu un disc ce blochează lumina, lăsând doar o rază concentrată să ajungă la proba vizualizată. În felul acesta, elementele apar luminoase pe un fundal întunecat (foto 4).

Microscopia în câmp întunecat (foto 5) are multe aplicații și ajută la identificarea nu doar a borreliilor (din care există peste 400 de specii din care doar 30 paraziteaza si omul), ci și a altor spirochete (spirilium, leptospirele, treponemele, cristospira etc.), precum și a co-infecțiilor.
Limitele acestei metode sunt reprezentate de faptul ca nu identifica tipul de spirocheta si nu poate indica patogenitatea ei.
Microscopia în câmp întunecat realizată după încheierea unui tratament pentru boala Lyme arată fără dubii dacă acesta a avut sau nu rezultat. De multe ori, în urma antibioterapiei, pacienții nu mai prezintă simptome de borelioză și sunt tentați să întrerupă tratamentul. Acest test arată clar dacă tratamentul poate fi încheiat sau trebuie continuat.

 

Citiți mai multe despre microscopia în câmp întunecat în capitolul referitor la testele disponibile pentru identificarea prezenței Borrelia burgdorferi în organism.

 

Vedeți aici cum arată spirochetele vizualizate la microscop.

LTT Elispot

In mai 2011 FDA (Food and Drug Administration) din SUA, impreuna cu CDC ( Centrul pentru preventia si controlul maladiilor ) au aprobat tehnica Elispot® – LTT (T spot). Testul are la baza eliberarea de interferon gamma ( IGRAs ) in testul de transformare limfocitara (LTT).
Nici un alt test de laborator pentru limfocitele T (Melissa® sau ITT ®) nu a obtinut inca aprobarea FDC/CDC.

FDA argumenteaza :
“ … un rezultat pozitiv (al Elispot LTT) sugereaza posibilitatea infectiei iar un rezultat negative infirma infectia….”

“ Rezultatele (Elispot LTT) se pot obtine in 48 ore (ITT sau Melissa nu ofera aceasta posibilitate)
Center for Desease Control and Prevention.Updated Guidelines for Using Interferon Gamma Release Assays to Detect Mycobacterium tuberculosis infection .United States . MMWR 2010 ; 59 ( No . RR-5 )
http:/www.cdc.gov/pdf/rr5905.pdf

In conformitate cu acest studiu : 100% specificitate a Borrelia Elispot-LTT

…Sensibilitatea Elispot este estimate la 84 % si specificitatea este de 94 %
…Testul ELISPOT ofera date robuste , reproductibile
…ELISPOT poate fi retestat pentru achizitia de informatii utile in testele de supraveghere
….cele doua teste impreuna ( ELISPOT + CD3-/CD57+ ) se completeaza in incercarea de a intelege imunitatea T-cell mediate in vivo….

Conform acestor studii:
82-100% Specificitate Borrelia Elispot LTT
84 % sensibilitate Borrelia Elispot LTT

Infectia borreliana activeaza in acelasi timp atat raspunsul imun umoral cat si pe cel celular (limfocitele T). Odata ce activitatea bacteriana a incetat , raspunsul imun cellular (limfocit T) nu mai este prezent.

Monitorizarea unui tratament eficient nu se poate baza pe titrul de anticorpi , intrucat acesti anticorpi pot fi detectati in organism chiar si peste ani. In plus in stadiul I al infectiei Lyme (eritemul caracteristic sau “ raceala de vara“) anticorpii pot fi detectati in sange abia dupa cateva saptamani de la infectie iar in unele cazuri niciodata.

Borrelia Elispot LTT elimina aceste probleme. Testul cuantifica activitatea prezenta , de moment a Borreliei burgdorferi atat in infectiile acute cat si in cele cronice. Elispot LTT are o sensibilitate atat de inalta incat poate detecta in sange chiar si activitatea unei singure celule T reactive la Borrelia. Elispot LTT este extrem de util in monitorizarea terapiei pentru boala Lyme acuta si cronica. Elispot LTT ar trebui sa se negativeze la 6-8 saptamani de la incheierea tratamentului adecvat.

Borrelia burgdorferi Elispot LTT

Necesar probe : 3 x 8.5 ml CPDA eprubete- capac galben (nu se centrifugeaza , se pastreaza la temperatura camerei , nu se depoziteaza la rece)

Durata analizei : 2 zile (IMPORTANT: laboratorul are nevoie de aproximativ o saptamana pentru eliberarea rezultatului datorita etapelor pre si post analitice)

Indicatii
1. Diagnosticarea boala Lyme cronică
2. Diagnosticare boala Lyme acută
3. Determinarea duratei de tratament
4. Monitorizarea rezultatelor tratamentului

Lyme Diagnostic va mai ofera Elispot LTT pentru urmatoarele infectii bacteriene / virale :
– Chlamydia pneumonia – Elispot LTT
– Chlamydia trachomatis – Elispot LTT
– Erlichia / Anaplasma – Elispot LTT
– Yersinia – Elispot LTT
– Epstein- Barr –Virus ( EBV ) Elispot LTT
– Cytomegalo Virus Elispot LTT

Bibliografie:
– Lehman PV et al : Unique Strengths of ELISPOT for T cell Diagnostics in Kalyuzhny AE.Handbook of ELISPOT:Methods and Protocols , Methods in Molecular Biology , vol 792. 2nd Ed. Springer ;2012 : 3-23
– Center for Desease Control and Prevention.Updated Guidelines for Using Interferon Gamma Release Assays to Detect Mycobacterium tuberculosis infection .United States . MMWR 2010 ; 59 ( No . RR-5 )
– http:/www.cdc.gov/pdf/rr5905.pdf

CD 57+

Celulele CD 57+ reflecta gradul de activitate al unei infectii Lyme cronice. Numarul lor creste pana la nivelul normal dupa o terapie de success ( aceasta crestere are loc inca din timpul tratamentului sau spre sfarsitul acestuia ).
Progresia infectiei cronice ( stadiul III ) in cazul Borreliozei Lyme duce la o slabire a sistemului imunitar . Aceasta este reflectata prin scaderea numarului de cellule CD 3 – /CD57+ NK . Celulele CD3-CD57+ reprezinta o subpopulatie a celulelor NK (natural killer cells).

Scaderea nivelului CD 57+ indica o infectie cronica lyme , netratata sau insufficient tratata. Aceste celule nu vor fi niciodata scazute in cazul unei infectii recente.

Diferenta intre Lyme cronic si alte boli neurologice este data tocmai de aceasta scadere , care nu apare in Scleroza Multipla , Lupusul Eritematos Diseminat sau Scleroza Laterala Amiotrofica. De asemenea nu exista o variatie a numarului lor in timpul zilei.

CD57+ reprezinta un parametru de laborator extrem de util in diagnosticul si tratamentul Bolii Lyme. Acesta ar trebui lucrat in paralel cu Elispot LTT , cel care reflecta activitatea celulelor T.

Avantajul CD 57+ in diagnosticul Borreliei
1. Rezultate in 5 zile
2. Utilizarea eprubetelor cu heparina standardizata mentine acuratetea masurarii celulelor NK timp de 3 zile

Succesul tratamentului este evidentiat de cresterea semnificativa a numarului de celule CD 57.Rezultatul este util in luarea unei decizii rapide asupra tratamentului, orientand medicul curant asupra extinderii duratei tratamentului sau asupra unei noi abordari a schemei de tratament.

Necesar proba: 1 x 6 ml eprubeta litiu-heparina – capac verde + 1 x 3 ml EDTA K 2 – capac mov (nu se centrifugeaza , se pastreaza la temperatura camerei , nu se depoziteaza la rece)

Durata analizei: 2 zile (IMPORTANT: laboratorul are nevoie de aproximativ o saptamana pentru eliberarea rezultatului datorita etapelor pre si post analitice)
Indicatii
1. Diagnosticarea Lyme cronic
2. Determinarea duratei de tratament
3. Monitorizarea rezultatelor tratamentului

BIBLIOGRAFIE:
– Stricker R.B. Long term decrease in Lymphocyte subset in a patient with chronic Lyme disease. Ann Agric. Environ Med (2002) http://www.lymenet.de/shgs/corryw/Immun-CD57-StatusbeiLB.pdf
– Lyme CD57 Test. http://www.healthcentersofamerica.com/information.cfm?id=144
– Stricker R.B. Winger EE. Decreased CD57 lymphocyte subset in patients with chronic Lyme disease. Immunol Lett 1, 76 (1) (2001) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11222912